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Quantitative PCR (qPCR) - Grundlagen, Durchführung, Interpretation und Troubleshooting


Eckdaten der Veranstaltung




  • Termin: Mittwoch, 3. November 2021
  • Uhrzeit: 10:00 Uhr - 17:00 Uhr
  • Teilnahmegebühr: 449,00 € (534,31 € inkl. MwSt.)
  • Veranstaltungsort: World Wide Web
  • Veranstaltungscode: OSPCR-1

Dieses Seminar wird in deutscher Sprache angeboten. Die Unterlagen werden in englischer Sprache zur Verfügung gestellt.

Zielgruppe

Angesprochen werden technische und wissenschaftliche Mitarbeiter aus der akademischen, industriellen und klinischen Forschung, sowie Mitarbeiter aus der Qualitätkontrolle und Assayentwicklung, die nukleinsäure-basierte Verfahren anwenden.

Lerninhalte

Es werden die Grundlagen einer quantitativen PCR aufgefrischt und die Besonderheiten, Stärken und Schwächen kurz dargestellt. Die Teilnehmer lernen, wie man einen qPCR Assay designed, etabliert und validiert. Anhand von Beispielen werden typische Fehlerquellen erläutert und Lösungen vorgestellt. Zusätzlich erhalten die Teilnehmer einen Überblick über gängige Methoden zur Datenauswertung, die anhand eines Rechenbeispiels vertieft werden.

Referent(en)

Jan Winter
(Diplom-Biologe)
Herr Winter ist seit 2018 als Produktmanager für PCR, qPCR und Magnetic Beads für die Firma Steinbrenner GmbH europaweit tätig. Er studierte Molekulare Biotechnologie an der Universität Heidelberg und forschte als PhD Student im Labor von Prof. Michael Boutros am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) mit Schwerpunkt Funktionelle Genomik. Er entwickelte nicht nur leading-edge CRISPR/Cas9 Tools, sondern etablierte auch Hochdurchsatz-qPCR Assays, für die er eine eigene Analysesoftware programmierte.

Programm

03.11.2021| Quantitative PCR (qPCR) - Grundlagen, Durchführung, Interpretation und Troubleshooting | Winter

qPCR Grundlagen
  • Funktionsprinzip einer qPCR
  • Vergleich PCR (Northern Blot), qPCR mit Stärken und Schwächen
  • Funktionsprinzip der verschiedenen Detektionsreagenzien (Farbstoff, Sonde)
  • Anwendungsfälle einer qPCR mit kurzen Beispielen anhand von Kundenfällen
    • Wo macht es Sinn, wo nicht?
  • Gängige qPCR-Geräte und -Verbrauchsmaterialien
  • Typische Kosten eines qPCR-Assays
    • Kostenvergleich mit End-Punkt PCR, NGS
  • qPCR-Parameter
    • Phasen, Cq, Fluoreszenz
  • Schmelzkurven
    • Wie und warum?
  • Wie werden Proben miteinander verglichen?

qPCR Assay Design
  • Wie designe/etabliere ich einen qPCR-Assay?
  • Worauf muss ich bei einer reversen Transkription achten?
    • Primer, Amplikons
  • Multiplexing
  • Notwendige Kontrollen
  • Referenzgene - How To
  • Protokoll und Handling eines qPCR-Assays
  • 1-Step vs. 2-Step qPCR

qPCR Assay Validation
  • Was sagen uns die Kontrollen?
  • Welche qPCR-Parameter kann ich als Qualitätskontrolle des Assays verwenden?
  • Linear Dynamic Range und Primer Efficiency
  • Ist ein Agarosegel zur Assayvalidierung notwendig?
  • Darf man Reagenzien innerhalb einer Versuchsreihe austauschen?

qPCR Troubleshooting (Beispiele, Modelle)
  • PCR-Inhibition
  • Welchen Einfluss hat die DNA/cDNA Konzentration?
  • Replikate (technisch/biologisch)
  • Niedrige Fluoreszenzwerte/Baseline
  • Was sagen Schmelzkurven über die Assayqualität?
  • Welcher Einfluss hat die Primer Konzentration?

Data Analysis
  • Verfügbare Software
  • Strategien / Modelle zur Datenauswertung
  • PCR-Effizienz pro Reaktion berechnen
  • ddCt
  • Relative Quantities
  • Effizienzkorrektur
  • ddCt vs. Relative Quantities

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